Les hormones prescrites en thérapeutique ou pour une contraception humaine ne sont pas complètement métabolisées dans l'organisme humain et sont rejetées sous leur forme originelle ou conjuguée de façon continue dans l'environnement via les eaux usées et les stations d'épuration. Compte tenu de leur effet actif sur les organismes vivants, elles constituent un danger pour les écosystèmes aquatiques. En effet, même si ces composés sont couramment retrouvés dans les milieux aquatiques à des teneurs relativement basses comparés à d'autres perturbateurs endocriniens, ils participent au dérèglement des cycles de reproduction des organismes aquatiques (féminisation des poissons mâles en rivières polluées par exemple). Compte tenu du peu de données environnementales sur le sujet et afin de mieux comprendre leur devenir une fois rejetés dans les eaux usées, il est nécessaire de développer des protocoles pour les analyser dans les différents compartiments de l'environnement. L'intérêt de cette communication est de présenter les résultats de la validation, selon la norme XPT 90-210, d'une méthode d'analyse de cinq hormones stéroïdiennes estrogéniques (estriol, 17α-estradiol, 17β-estradiol, estrone et 17α-éthinylestradiol) dans des eaux de surfaces, des influents et des effluents de stations d'épuration. En plus des paramètres classiques (limites de détection, rendements et répétabilité), la spécificité de la méthode et l'incertitude sur les résultats d'analyse sont évalués. L'influence du mode de conservation et son impact sur la stabilité des composés sont également présentés. Le traitement des échantillons se décompose en une étape de déconjugaison par hydrolyse enzymatique grâce à la β-glucuronidase (suc d'Helix pomatia), une étape d'extraction puis de purification sur deux phases solides successives (HLB et Florisil). Les extraits ainsi obtenus sont analysés par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse triple quadripolaire en tandem (mode multiple reaction monitoring). L'utilisation d'étalons internes deutérés permet de s'affranchir de certains effets de matrices et de contrôler pour tout nouvel échantillon l'efficacité de la méthode. Pour des effluents de station d'épuration par exemple, les rendements obtenus sont supérieurs à 72 % avec des coefficients de variation inférieurs à 16 %. Les limites de détection varient de 0,3 ng/L pour l'estrone à 1 ng/L pour la 17α-éthinylestradiol. La conservation au réfrigérateur d'échantillons d'effluents filtrés, testée pour des périodes allant de 1 à 7 jours après échantillonnage, est vérifiée pour des concentrations de l'ordre de 40ng/L.