Larix laricina (tamarack): somatic embryogenesis and genetic transformation
Résumé
Excised, immature zygotic embryos of Larix laricina (Du Roi) K. Koch (tamarack) gave rise to embryogenic cultures on modified Murashige and Skoog (MSG) medium supplemented with growth regulators. Three lines of embryonal masses were maintained for 1 year by biweekly subcultures prior to the maturation experiments. All of those lines showed the ability to produce mature somatic embryos. Both elevated medium osmolality (315.0-543.6 mmol.kg(-1)) and presence of abscisic acid (ABA) at 40 mu M stimulated the maturation process when applied simultaneously. Sucrose was most effective at 0.4 M, and polyethylene glycol (PEG) at 5 or 10% was effective only in combination with 0.2 or 0.4 M sucrose. The germination frequency of somatic embryos depended on both osmolality and ABA concentration in the maturation medium. Over 90%;, of mature somatic embryos were capable of secondary somatic embryogenesis when placed on the induction medium. This particular ability was exploited in order to achieve genetic transformation. Four vectors were delivered to the embryonal masses and somatic embryo cells via bombardment of DNA-coated Sold particles. The vectors pBI426 and pRT99gus carried a gene encoding resistance to kanamycin, pRT66gus to hygromycin, and pRT55gus to methotrexate. All vectors carried the gene coding for beta-glucuronidase (GUS) and were over 6 kilobases in size. Assays for both transient and stable transformation were carried out. The only vector that yielded two transgenic lines was pBI426. These lines of embryonal masses, designated as 2D1 and 2D2, were analysed by hybridization of the plasmid to the genomic Southern blots and revealed several insertions of the vector. Line 2D1 gave rise to young germinants that expressed the GUS gene uniformly throughout the root, hypocotyl, and cotyledons but failed to develop further. Line 2D2 gave rise to transgenic plants that displayed random and ''patchy'' expression of the GUS gene. Polymerase chain reaction (PCR) amplification of the GUS insert in 6-month-old 2D2 transgenic plants showed the presence of diagnostic fragment in all parts of the plants.
Des embryons zygotiques immatures de Larix laricina (Du Roi) K. Koch (mélèze laricin) ont donné du tissu embryogène sur un milieu Murashige et Skoog modifié (MSG) par l’ajout de régulateurs de croissance. Trois lignées embryogènes ont été maintenues pendant 1 an par sous-cultures bihebdomadaires avant les expériences de maturation. Ces trois lignées ont démontré leur aptitude à produire des embryons somatiques matures. Une osmolalité élevée (315,0– 543,6 mmol⋅kg–1) et 40 µM d’ABA ont stimulé le processus de maturation lorsqu’appliqués simultanément. Le saccharose était le plus efficace à 0,4 M; le polyéthylène glycol (PEG) à 5 ou 10% était efficace seulement lorsque combiné à 0,2 ou 0,4 M de saccharose. La fréquence de germination des embryons somatiques dépendait à la fois de l’osmolalité et de la concentration d’ABA dans le milieu de maturation. Plus de 90% des embryons somatiques matures étaient capables d’embryogenèse somatique secondaire lorsque placés sur un milieu d’induction. Cette particularité a été exploitée en vue de la transformation génétique. Quatre vecteurs ont été introduits dans les masses embryogènes et les cellules d’embryons somatiques par bombardement de particules d’or recouvertes d’ADN. Les vecteurs pBI426 et pRT99gus portaient un gène de résistance à la kanamycine, pRT66gus à l’hygromycine et pRT55gus au méthotrexate. Tous les vecteurs portaient le gène codant pour la β-glucuronidase (GUS) et avaient une dimension de plus de 6 kb. Des tests ont été effectués pour vérifier si la transformation était transitoire ou stable. Le vecteur pBI426 est le seul qui a permis d’obtenir deux lignées transgéniques. Des hybridations Southern du plasmide sur l’ADN de ces lignées, identifiées 2D1 et 2D2, ont révélé plusieurs insertions du vecteur. La lignée 2D1 a produit de jeunes plantules exprimant le gène GUS uniformément sur toute la racine, l’hypocotyle et les cotylédons mais ces plantules ne se sont pas développées davantage. La lignée 2D2 a donné des plantules transgéniques qui montraient une expression aléatoire et localisée du gène GUS. L’amplification PCR du gène GUS inséré dans des plantules transgéniques 2D2 âgées de 6 mois a révélé la présence du fragment diagnostique dans toutes les parties des plants