Les acides gras phospholipidiques (PLFA) sont des constituants essentiels des membranes cellulaires, rapidement métabolisés après la mort de l’organisme. Ils sont ainsi considérés comme un marqueur de la biomasse vivante. Les PLFAs ont une diversité structurale importante de par la variété des acides gras, dont certains sont spécifiques de groupes de microorganismes (gram positifs, gram négatifs, fongiques, ou d’autres plus spécifiques). Dans les sols, où ces organismes sont délicats à appréhender, les profils de PLFA sont des indicateurs permettant d’observer les évolutions de la biomasse microbienne, que ces évolution soient temporelles, spatiales ou liées aux pratiques culturales. La méthodologie analytique classique est d’extraire les lipides du sol puis de les séparer en lipides neutres, glycolipides et PLFA. Les PLFA subissent ensuite une transméthylation par méthanolyse alcaline afin d’obtenir les esters méthyliques correspondants, facilement analysables par chromatographie gazeuse (GC) couplée à un détecteur par ionisation de flamme (FID). Même si l’analyse des PLFA est couramment pratiquée, ce protocole analytique restait à optimiser. En effet, il comporte de nombreuses étapes qui limitent considérablement sa répétabilité et rendent longue et laborieuse sa mise en oeuvre. Nous avons identifié les points critiques du protocole à la fois selon des critères de gain de temps, de répétabilité et de spécificité, puis chacun a été optimisé en veillant à conserver une bonne sensibilité. Ceci nous a conduits à accélérer l’étape d’extraction par l’utilisation d’ultrasons. Pour l’étape de dérivation, déterminante et laborieuse dans le protocole classique, nous avons opté pour une méthode en ligne : la transméthylation in-situ dans l’injecteur de GC. Par ailleurs, le couplage avec la spectrométrie de masse a permis d’obtenir une bonne spécificité dans des extraits complexes de sols. Ainsi, l’identification est effectuée non seulement sur la base des temps de rétention des standards mais aussi par comparaison des spectres d’impact électronique. La quantification s’opère en mode SIM sur la somme de 3 ions (Selective Ions Monitoring, suivi d’ions sélectifs) pour une plus grande sélectivité et un bruit de fond minimum. Les différents points d’amélioration ont été testés par comparaison statistique avec la méthode classique. Cette méthode a été appliquée sur des échantillons de sols provenant des différentes parcelles d’un site agricole. Les calculs d’indicateurs à l’aide des profils d’acide gras ont démontré son efficacité à différencier les parcelles selon leurs itinéraires culturaux.