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Poster communications

Projet InnovoMass : Identification de biomarqueurs protéiques de la qualité ovocytaire par spectrométrie de masse ICM-MS / Top Down /Bottom up/

Résumé : L’ovocyte mammalien acquière son aptitude au développement embryonnaire grâce à des interactions permanentes avec les cellules de cumulus (CC) qui l’entourent. Ces dernières peuvent donc refléter sa qualité. Le profiling par spectrométrie de masse MALDI-TOF à partir de cellules entières (ICM-MS, Intact Cells Mass Spectrometry) permet d’obtenir un profil peptidique et protéique caractéristique d’un type cellulaire donné. Nous avons adapté l’ICM-MS à l’analyse de CC bovines et humaines et aussi à l’ovocyte bovin. Les profils spectraux obtenus à partir de CC entières ou de biopsies de cumulus ont révélé plus de 200 pics protéiques entre 3 et 25 kDa. L’analyse différentielle des profils de CC entre différentes conditions physiologiques en relation avec la capacité de l'ovocyte à se développer en embryon viable a permis de caractériser plusieurs dizaines de marqueurs potentiels de maturation et de qualité ovocytaire. Pour identifier les peptides ou les protéines différentiellement exprimés, une approche bottom-up par SDS-PAGE puis nanoLC-MS/MS à haute résolution (LTQ Velos Orbitrap) a été réalisée sur les CC bovines. Parmi 2378 protéines identifiées, 530 ont un poids moléculaire <25 kDa. Toutefois, en raison de la présence des modifications post-traductionnelles, aucune correspondance n’a pu être faite entre la masse théorique des protéines identifiées et le pic détecté par profiling MALDI-TOF. Par conséquent, une approche ciblée par Top Down a été réalisée sur les espèces moléculaires entières et intactes. Les extraits de protéines/peptides (moins de 30 μg au total) obtenus à partir de 80 complexes cumulus-ovocytes (CCO) bovins et CC de 12 ovocytes matures humains ont été dessalés et concentrés. Après fractionnement et enrichissement, les petites espèces moléculaires ont été analysées par spectrométrie de masse en tandem à haute résolution (LTQ Velos Orbitrap) et identifiées à l’aide du logiciel ProSight PC sur des bases de données bovines ou humaines annotées en utilisant différentes options de recherche (Masse Absolue ou Biomarqueur). Au total, 180 pics m/z ont été sélectionnés à la fragmentation. 28 pics ont été formellement identifiés dans les CCO bovins et CC humaines et caractérisés sur le plan structural avec la mise en évidence de modifications post-traductionnelles telle que l’acétylation N-terminale. Parmi les molécules identifiées, 8 correspondent à des marqueurs révélés par ICM-MS chez la vache et 2 chez la femme. Parmi ces marqueurs, plusieurs sont communs et correspondent à la famille des thymosines (thymosin-a1, thymosin-b4 et thymosin-b10) - petites protéines de 4-5 kDa impliquées dans la réponse immunitaire et la régénération des tissus. Nous avons montré, dans les CC bovines, qu’au niveau des transcrits, l’expression des gènes codant pour ces molécules augmente pendant la maturation et que les protéines thymosines-b4 et b10 sont colocalisées avec la F-actin et sont impliquées dans la restructuration du cumulus et la formation de la matrice extracellulaire. En conclusion, nous avons développé une stratégie hybride originale alliant le profiling MALDI-TOF à partir de cellules entières et l’analyse par Top down qui permet l'identification et la caractérisation structurale de biomarqueurs dans une gamme de masse rarement atteinte par les approches classiques de protéomique. Cette approche, nécessitant peu d'échantillons (cellules ou extrait) s’adapte parfaitement aux modèles biologiques précieux et rares comme le sont les ovocytes et les cellules de cumulus qui l’entourent.
Document type :
Poster communications
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https://hal.inrae.fr/hal-02809357
Contributor : Migration Prodinra <>
Submitted on : Saturday, June 6, 2020 - 6:49:38 AM
Last modification on : Thursday, August 5, 2021 - 3:51:18 AM

Identifiers

  • HAL Id : hal-02809357, version 1
  • PRODINRA : 256696

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Citation

Valérie Labas, Ana Paula Teixeira, Audrey Gargaros, Véronique Cadoret, Fabrice Guerif, et al.. Projet InnovoMass : Identification de biomarqueurs protéiques de la qualité ovocytaire par spectrométrie de masse ICM-MS / Top Down /Bottom up/. 5. Journées d'Animation Scientifique du département Phase (JAS Phase 2013), Oct 2013, Paris, France. 2013. ⟨hal-02809357⟩

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