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, Broyer les échantillons au mortier avec du matériel RNase « free » dans l'azote liquide
, Transvaser un volume de poudre congelée (300 µl) dans un tube de 2 ml contenant de l'azote liquide
, Ajouter 600 µl de tampon de lyse RLT additionné de ?-mercaptoéthanol (10 µl/1ml). A préparer juste avant utilisation. Vortexer vigoureusement
, Déposer le lysat sur 1 colonne violette (Qiashredder) par échantillon
, Centrifuger 2 min à 13000 rpm à température ambiante
, Prélever avec précaution le filtrat et le placer dans un tube de 1.5 mL sans récupérer le culot de débris
, Ajouter 450 µl d'EtOH 100% au filtrat et homogénéiser immédiatement à la pipette (ne pas utiliser de vortex, ni de centrifugation à cette étape)
, Déposer le mélange (750 µl) sur 1 colonne rose
, Centrifuger 30s à 13000 rpm à température ambiante et éliminer le filtrat
, Répéter l'étape 9 pour traiter la totalité du volume
Free DNase Set. 12a. Préparation de la solution DNase I stock : dissoudre la DNase I solide, 1500. ,
, Kunités) dans 550µl d'eau RNase-free fournie avec le kit. Mélanger doucement en inversant le tube
, Ajouter 350 µL de tampon RW1 dans la colonne rose, laissé agir 5 min et centrifuger 30 s à 13 000 rpm. Eliminer le filtrat. 12c. Ajouter 10µL de solution stock de DNase à 70µl de tampon RDD
, Laisser 15 min à température ambiante. 12d. RNAtotaux : Ajouter 350 µL de tampon RW1 dans la colonne rose, laissé agir 1 min et centrifuger 30 s à 13 000 rpm
, Ajouter 500µLde tampon RPE (contenant de l'éthanol) dans la colonne rose. Centrifuger 30 s à 13000 rpm à température ambiante et éliminer le filtrat
, Réutiliser le tube de 2 ml Ajouter 500µL de tampon RPE dans la colonne rose. Centrifuger 1 min à 13000 rpm à température ambiante et éliminer le filtrat
, Placer la colonne sur un nouveau tube collection 2 mL (fourni) et centrifuger 2 min à 13000 rpm pour éliminer toute trace de tampon RPE
, Placer la colonne rose sur un microtube de 1,5 mL fourni par le kit, Laisser imbiber 10 min à température ambiante
, Centrifuger 1 min à 13000 rpm à température ambiante et répéter l'étape, vol.16
, VII.5. Annexe, vol.5
,
,
Easy Vector Systems (Promega) ,
, LB et LB agar Pour les boites de LB agar