Les défensines sont des peptides antimicrobiens naturels de l'immunité innée des animaux. Deux défensines aviaires nommées AvBD2 et AvBD7, extraites et purifiées à partir de la moelle osseuse du poulet, sont actives contre des bactéries pathogènes Gram-et Gram+ et sont remarquablement résistantes à la protéolyse. De manière importante, l'efficacité antimicrobienne de l'AvBD7 a été récemment démontrée dans un modèle murin de salmonellose systémique. Ces propriétés particulières font de l'AvBD2 et de l'AvBD7 des candidats thérapeutiques prometteurs en alternative aux antibiotiques. Par ailleurs, la production de ces molécules à grande échelle est nécessaire à leur développement industriel. Le projet visait donc à faire la preuve de concept de production recombinante d'AvBD2 et d'AvBD7 fortement antimicrobiennes. L'objectif premier était de développer un système d'expression (i) chez la levure Yarrowia lipolytica qui bénéficie d'outils performants (promoteurs inductibles, nouvelles séquences de sécrétion) pour la production de protéines hétérologues et (ii) chez la cellule S2 d'insecte qui a fait ses preuves pour produire des molécules structuralement très proches des défensines. Le second objectif était de définir et exprimer des variants d'AvBD2 et d'AvBD7 substitués sur certains acides aminés choisis pour augmenter l'activité antibactérienne des molécules vis-à-vis d'un panel de souches bactériennes pathogènes en comparant cette activité à celle des molécules naturelles. Le troisième objectif était de monter en échelle de production des variants les plus actifs et de fournir des protocoles de production et de purification des défensines transférables. Les retombées en termes d'application thérapeutique alternative aux antibiotiques sont attractives, en particulier pour l'industrie pharmaceutique, avec une demande importante en santé publique et vétérinaire. Ce projet à fort potentiel de valorisation a été monté avec l'intention de protéger les variants d'AvBD2 et d'AvBD7 obtenus grâce au dépôt d'une demande de brevet. Un point positif important atteint avec ce projet est la construction du gène de l’AvBD7 dans Yarrowia lipolytica comprenant la séquence d’adressage complète pré-pro-Lip2 native (SSLP) qui permet de produire plus efficacement la défensine. De plus, une méthode développée par le partenaire 1 a permis d’évaluer la quantité produite. Cette quantité a été améliorée par le partenaire 2 en jouant sur la surexpression d’une protéine chaperonne (PDI) de Yarrowia, sur la composition de son milieu de culture, et sur les conditions de fermentation et d’induction du promoteur au cours du "feedbatch". Néanmoins, le milieu synthétique de la culture industrielle consécutive a rendu difficile la quantification de la production de défensines par ELISA. Ces résultats soulignent la difficulté d’obtention de ces molécules à des concentrations permettant la mesure de l’activité biologique. Ils montrent aussi que nous avons réussi à: (i) faire produire chaque défensine par Yarrowia lipolytica en optimisant le promoteur et la séquence signal de la construction génique, ce qui n’avait jamais été fait auparavant; (ii) multiplier par dix le niveau de production en ajoutant la protéine chaperonne de Yl et en augmentant l’échelle de production; (iii) identifier des acides aminés potentiellement cibles de mutations visant à augmenter l’activité antimicrobienne. Finalement, même si les deux défensines aviaires ont pu être produites en fermenteurs à des concentrations non exploitables (environ 3mg/L), il est fort probable que leur production chez l’hôte naturel par les cellules hétérophiles doit se faire dans des conditions particulièrement difficiles à transposer en système levure et à l’échelle industrielle. Il reste toutefois imaginable que la production de ces molécules à activité antimicrobienne puisse être amplifiée in vivo pour faire barrière aux infections en jouant sur la stimulation de l’animal hôte par voie alimentaire ou par voie de vaccination.