Production et analyse de lignées stables de truites arc-en-ciel (Oncorhynchus mykiss) transgéniques : expression de gènes rapporteurs sous contrôle du promoteur de 2,4 Kb du gène de la prolactine de saumon chinook (Oncorhynchus tschawytscha)
Résumé
In order to better understand the PRL roles in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss), a long term project is to produce a new biological model obtained by PRL cells ablation : hypoprolactinemic transgenic trout. At first, it is necessary to control transgene expression strictly in PRL cells. The objective of our study was to analyze the expression driven by the 2.4 kb promoter of the PRL gene isolated in chinook salmon (sPRL) (Oncorhynchus tschawytscha), in transgenic rainbow trout stable lines. Two constructs were microinjected into rainbow trout eggs. Both constructs contained the sPRL promoter fused to prokaryotic reporter gene which was either LacZ or CAT. The CAT assay analysis revealed a strong specific expression in the pituitary gland. In the LacZ expression : β-galactosidase activity was detected in cells organized as follicles and localized in the rostral pars of the adenohypophysis. These cells are characteristic of PRL synthesis cells. A double labeling showed colocalization of endogenous PRL as well as enzymatic activity in pituitary gland sections. These studies demonstrated that the reporter gene expression driven by the sPRL promoter was specific to the PRL cells in vivo. In addition, our work suggests that not all PRL cells were systematically able to express transgene. It is well known that integration site is able to influence the regulation of the transgene expression and for example to be responsible of variegation (position effect variegation). To study the mosaic expression of the transgene independantly of the integration site, we produce 13 families F2 family corresponding to 9 distinct DNA electrophoretic patterns and one F3 family. Analysis of LacZ gene expression under control of sPRL promoter permit to conclude that : 2/3 of the families were able to express the transgene ; not all the PRL cells expressed the transgene, and this was consistent no matter the individual or the family studied ; the level of the transgene expression was variable between individuals of the same family, regardless the family studied. The variability of the transgene expression could be due to the combination of several factors such as the promoter size, the high integrated transgene copy number, the prokaryotic sequences, the inhibitory effect of the lacZ reporter gene, or due to the use of unpure trout lines. In conclusion, this study is particularly original due to the obtaining of cell-specific transgene expression conserved throughout 4 generations. Furthermore, our work puts into evidence the problem of variability of transgene expression in stable transgenic fish lines, a problem which as yet, has been poorly described in fish.
L'objectif de cette étude a consisté en l'analyse de l'expression conduite par le promoteur du gène de la PRL isolé chez le saumon chinook (sPRL) (Oncorhynchus tschawytscha), dans des lignées stables de truites arc-en-ciel transgéniques (Oncorhynchus mykiss). Pour cela, 2 constructions ont été micro injectées dans des oeufs de truites. Toutes les deux contiennent le promoteur sPRL fusionné aux gènes rapporteurs bactériens lacZ ou CAT. Une analyse par dosage de l'activité CAT nous a permis de mettre en évidence une expression forte, et spécifique de l'hypophyse. Lorsque l'expression du gène lacZ est analysée, l'activité β-galactosidase est détectée dans la pars rostral de l'adénohypophyse dans des cellules regroupées en follicules, caractéristiques des cellules à PRL. Sur des coupes d'hypophyses, un double marquage révèle une co localisation de la PRL endogène et de l'activité enzymatique. Cette étude montre donc que l'expression degènes rapporteurs sous contrôle du promoteur sPRL est spécifique des cellules à PRL, in vivo. Lors de ce travail, il est apparu que toutes les cellules à prolactine n'expriment pas systématiquement le transgène. L'analyse de l'expression du gène lacZ sous contrôle du promoteur sPRL pour les individus de 13 familles F2 et 1 famille F3 représentant 9 profils électrophorétiques distincts de migration de l'ADN permet de conclure que : - 2/3 des familles possèdent des individus qui expriment le transgène, - quels que soient l'individu et la famille étudiés, toutes les cellules à prolactine n'expriment pas le transgène (variegation) - l'expression du transgène est variable entre 2 cellules d'un même individu et 2 individus d'une même famille. Cette variabilité d'expression pourrait résulter de la combinaison de différents facteurs comme la taille du promoteur, la forte quantité de copies de transgène intégré, la présence de séquences procaryotes, les effets inhibiteurs du gène rapporteur lacZ, ou encore l'utilisation de lignées non pures. En conclusion ce travail apparait comme particulièrement original du fait de l'obtention d'une expression cellules-spécifique d'un transgène stabilisée sur 4 générations. De plus, cette étude pose le problème de la variabilité d'expression du transgène dans des lignées stables de poissons transgéniques, problème très peu étudié chez les poissons.