Metabolic engineering of the yeast Yarrowia lipolytica for the production of dicarboxylic acids from oil feedstock
Ingénierie métabolique de la levure Yarrowia lipolytica pour la production d'acides dicarboxyliques à partir d'huiles végétales
Résumé
Long-chain dicarboxylic acids (DCA) are intermediates of industrial interests (polymers, plastics, lubricants, antibiotics and fragrances) which are difficult to produce by chemical synthesis. The aim of this study is to develop a biotechnological process to produce these compounds by bioconversion of renewable raw material by the yeast Yarrowia lipolytica. In wild type yeast, fatty acids are degraded mainly through the Β-oxidation pathway.
We blocked the Β-oxidation pathway by disruption of the six genes which code the acyl-CoA oxydases thus allowing to reorientate the fatty acids flux towards the ω-oxidation which led to the production of DCA. Further, the improvement of DCA production was obtained by increasing the hydroxylation activity, involved in the first stage of ω-oxidation, by overexpression of genes coding the NADPH cytochrome P450 reductase and the 12 P450 cytochromes. Nevertheless, half of the bioconversion substrate was accumulated in the cytoplasmic lipid bodies. This storage was decreased, by the disruption of two genes, DGA1 and LRO1, involved in this pathway, thus allowing an increase in the bioconversion yield.
Finally, the study of insertion mutants revealed an involvement of 5 ABC transporter of the PDR type family which confer pleiotropic drug resistance. The functional study of this family suggested that the ABC transporter coded by ABC1 gene was a membrane exporter specific for long chain alkanes and represents the first ABC transporter of the PDR type identified responsible for the export of physiological molecules.
Overall, this work has provided the development of a genetically modified strain of Y. lipolytica to produce DCA from vegetable oils.
We blocked the Β-oxidation pathway by disruption of the six genes which code the acyl-CoA oxydases thus allowing to reorientate the fatty acids flux towards the ω-oxidation which led to the production of DCA. Further, the improvement of DCA production was obtained by increasing the hydroxylation activity, involved in the first stage of ω-oxidation, by overexpression of genes coding the NADPH cytochrome P450 reductase and the 12 P450 cytochromes. Nevertheless, half of the bioconversion substrate was accumulated in the cytoplasmic lipid bodies. This storage was decreased, by the disruption of two genes, DGA1 and LRO1, involved in this pathway, thus allowing an increase in the bioconversion yield.
Finally, the study of insertion mutants revealed an involvement of 5 ABC transporter of the PDR type family which confer pleiotropic drug resistance. The functional study of this family suggested that the ABC transporter coded by ABC1 gene was a membrane exporter specific for long chain alkanes and represents the first ABC transporter of the PDR type identified responsible for the export of physiological molecules.
Overall, this work has provided the development of a genetically modified strain of Y. lipolytica to produce DCA from vegetable oils.
Les acides dicarboxyliques (DCA) sont des composés de base pour la production de polymères, plastiques, lubrifiants, antibiotiques et parfums. Bien que de grand intérêt, les DCA qui comportent une chaîne aliphatique supérieure à douze atomes de carbone sont difficilement synthétisables par la voie chimique. L'objet de cette étude est de développer un procédé biotechnologique pour produire ces composés par bioconversion de matières premières renouvelables (huile de tournesol oléique) via la levure Yarrowia lipolytica.
Chez les souches sauvages, les acides gras sont principalement dégradés par la voie de la Β-oxydation. Nous avons bloqué la première étape de la Β-oxydation par disruption séquentielle des six gènes codant les acyl-CoA oxydases permettant ainsi de réorienter le flux d'acides gras vers l'ω-oxydation qui conduit à la production de DCA. L'amélioration de la production des DCA a été obtenue par l'augmentation de l'activité d'hydroxylation, impliquée dans l'ω-oxydation, en surexprimant les gènes codant la NADPH cytochrome P450 réductase et les 12 cytochromes P450. Néanmoins, la moitié du substrat s'accumule dans les corps lipidiques. Ce stockage a été réduit, par disruption de gènes, entraînant ainsi une augmentation du rendement de bioconversion.
Enfin, l'étude de mutants d'insertion a révélé l'implication de 5 ABC transporteurs PDR qui confèrent la résistance aux drogues. L'étude fonctionnelle de cette famille a démontré que le transporteur Abc1p serait un exporteur membranaire spécifique des alcanes à longue chaîne carbonée, constituant le premier ABC transporteur PDR responsable de l'export de molécules physiologiques.
Ces travaux ont permis de développer une souche améliorée de Y. lipolytica pour la production de DCA à partir d'huiles végétales.
Chez les souches sauvages, les acides gras sont principalement dégradés par la voie de la Β-oxydation. Nous avons bloqué la première étape de la Β-oxydation par disruption séquentielle des six gènes codant les acyl-CoA oxydases permettant ainsi de réorienter le flux d'acides gras vers l'ω-oxydation qui conduit à la production de DCA. L'amélioration de la production des DCA a été obtenue par l'augmentation de l'activité d'hydroxylation, impliquée dans l'ω-oxydation, en surexprimant les gènes codant la NADPH cytochrome P450 réductase et les 12 cytochromes P450. Néanmoins, la moitié du substrat s'accumule dans les corps lipidiques. Ce stockage a été réduit, par disruption de gènes, entraînant ainsi une augmentation du rendement de bioconversion.
Enfin, l'étude de mutants d'insertion a révélé l'implication de 5 ABC transporteurs PDR qui confèrent la résistance aux drogues. L'étude fonctionnelle de cette famille a démontré que le transporteur Abc1p serait un exporteur membranaire spécifique des alcanes à longue chaîne carbonée, constituant le premier ABC transporteur PDR responsable de l'export de molécules physiologiques.
Ces travaux ont permis de développer une souche améliorée de Y. lipolytica pour la production de DCA à partir d'huiles végétales.
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