En physiologie de la reproduction, l’ovaire est un organe clé en lien avec la fertilité chez la femelle, qui repose sur la qualité des ovocytes. C’est un organe très différentié, traversé par de nombreux vaisseaux sanguins, qui renferme plusieurs follicules de différentes tailles contenant chacun un ovocyte. A chaque cycle, plusieurs follicules antraux entrent dans la phase terminale de la folliculogenèse. La plupart rentrent en atrésie alors que le follicule dominant en croissance abouti à une ovulation. Nous soutenons l’hypothèse qu’une hiérarchie fonctionnelle existe entre les follicules en raison de leur positionnement dans l’organe et de leur niveau de vascularisation qui modulerait ainsi certaines voies de signalisation. Notre objectif est d’avoir une vue globale de l’anatomie de l’ovaire ainsi que la distribution précise des biomolécules entre différents follicules. Nous avons développé l’approche d’une imagerie multimodale associant l’Imagerie par Résonance Magnétique (IRM), l’Imagerie Optique histologique (IO), et l’Imagerie Moléculaire par Spectrométrie de masse (IMS) en lipidomique. En effet, le métabolisme des lipides est crucial pour la croissance folliculaire et la maturation des ovocytes. De plus une machinerie moléculaire complexe existe dans les cellules folliculaires somatiques et l’ovocyte qui permet de le réguler, mais son rôle au cours de la dominance folliculaire est peu étudié. Le développement de l’imagerie ex-vivo multimodale associant l’IRM 3D, l’ISM 2D et l’IO 2D, appliquée à l’ovaire de brebis, nous a permis de visualiser la position des follicules antraux en 3D et déterminer leur profil lipidique, spécifique de chaque compartiment et type cellulaire. Au cours de l’analyse, nous avons identifié des verrous et des leviers méthodologiques pour la réalisation de l’imagerie multimodale. Les difficultés résident dans la standardisation de la préparation de l’organe et des coupes de tissus pour être analysé sous différentes modalités (compatibilité), la reconstruction en 3D pour l’ISM (gestion de big data), et le traitement d’images pour un alignement multimodal du 2D avec le 3D. Néanmoins, cette approche a permis de caractériser des nouveaux critères de phénotypage physiologique et moléculaire qui ouvrent de nouvelles voies d’investigation de folliculogenèse ovarienne.