Introduction et objectifs : Clostridioides difficile (CD) est l’entéro-pathogène majoritaire des diarrhées associées aux antibiotiques et des colites pseudo-membraneuses dans le monde. Le développement de résistances aux antibiotiques chez CD représente ainsi un risque majeur pour la santé publique mondiale. Les modifications des composants de la surface bactérienne sont responsables d’une diminution de l’efficacité de composés antimicrobiens chez les bactéries gram-positives. La D-alanylation des polysaccharides de surface diminue l’affinité et l’efficacité des composés antimicrobiens cationiques (CAMPs) pour la surface bactérienne. Chez CD, la localisation de la D-alanylation est inconnue et son implication dans la résistance aux antibiotiques n’est pas élucidée. L’objectif de notre étude est de déterminer le site de la D-alanylation chez CD et d’étudier son rôle dans la sensibilité aux antibiotiques. Matériel et méthodes : Un mutant Δdlt a été construit et caractérisé pour différents phénotypes. Les deux polysaccharides majeurs de CD, le polysaccharide de type II (PSII) et l’acide lipotéichoïque (LTA) du mutant Δdlt et de sa souche parentale ont été purifiés et leur structure a été analysée et comparée par RMN. Résultats, discussion et conclusion : L’absence de D-alanylation chez le mutant Δdlt a été tout d’abord confirmée. Le mutant Δdlt possède une hydrophobicité de surface plus importante que la souche parentale. Ce mutant est plus mobile, adhère moins, mais forme plus de biofilm que la souche parentale. De plus, l’analyse des polysaccharides a mis en évidence la présence de D-alanine sur le LTA de la souche parentale mais pas sur le LTA du mutant Δdlt. Aucune fonction D-alanine n’a été identifiée sur les PSII purifiés. Par ailleurs, les essais de sensibilité aux antibiotiques ont démontré une augmentation de la sensibilité du mutant Δdlt à la bacitracine, à la téicoplanine, à la daptomycine et à des CAMPs de synthèse. Nos résultats mettent en évidence la D-alanylation exclusive du LTA chez CD. Ces résultats soutiennent l’intérêt porté à la D-alanylation comme potentielle cible thérapeutique dans le traitement des infections à CD.