Le métabolisme des fructanes chez Lolium perenne L. : Clonage et expression fonctionnelle de deux fructosyltransférases ; implication dans la croissance et la tolérance à la défoliation
Résumé
Fructans are the main storage compound in perennial ryegrass (Lolium perenne L.). To get a better un-derstanding on fructan involvement in leaf growth and defoliation tolerance, and to explain fructan biosynthesis at molecular level, several fructan biosynthetic enzymes were characterized and their regulation was studied. We screened a cDNA library of L. perenne by using the onion (Allium cepa) fructan:fructan 6G-fructosyltransferase (6G-FFT) and the Poa ampla sucrose:fructan 6-fructosyltransferase (6 SFT) as probes. Full length Lp6G-FFT and Lp6-SXT clones were isolated with significant homologies to vacuolar type fructosyltransferases and invertases. The functionality of the cDNAs was tested by heterologous expression in Pichia pastoris and/or in Sf9 cells. The recombinant proteins demonstrated, both 6G-FFT and fructan:fructan 1-fructosyltransferase activities (1 FFT), and 6-SFT activity, respect-tively. 6-SFT activity was not identical to that in barley since it did not use 1-kestotriose as fructosyl acceptor but 6G-kestotriose. Other putative fructosyl acceptors are under investigation. The present results have led us to reconsider fructan synthesis pattern in L. perenne. Fructans might be produced by a three-enzyme system instead of a four as previously suggested (Pavis et al., 2001a): 1 SST, 6G-FFT/1-FFT and 6-SFT. Sucrose:sucrose 1 fructosyltransferase (1 SST) allows the produc-tion of 1-kestotriose, 6G-FFT the synthesis of inulins and inulin neoseries by using 1-kestotriose as fructosyl donor and sucrose as fructosyl acceptor and an original 6-SFT would allow the synthesis of levan neoseries by using sucrose as fructosyl donor and probably 6G-kestotriose as fructosyl acceptor. The activity of 1-SST and 6G-FFT was investigated with respect to developmental stage, tissue distribution and alterations in carbohydrate status. Lp1-SST, Lp6G-FFT and Lp6-SXT were predo-minantly expressed in the basal part of elongating leaves and leaf sheaths. Expression of genes declined along the leaf axis, in parallel with the spatial occurrence of fructan and fructosyltransferase activities. Surprisingly, Lp6G-FFT was highly expressed in photosynthetically active tissues where very low extractable fructosyltransferase activity and fructan amounts were detected, suggesting a post-transcriptional expression regulation. Lp1 SST and Lp6-SXT were also highly expressed in leaf blades of plants, induced to accumulate fructans, without concomitant increase in 1-SST activity or fructan levels in this tissue. Regulation of Lp1-SST, Lp6G-FFT and Lp6-SXT gene expression depends on the tissue according to its sink-source status. To get a better understanding of fructan metabolism regulation during regrowth of Lolium perenne and to evaluate the role of carbon assimilation of new leaf tissues in refoliation, two contrasting varieties for carbohydrate metabolism, Aurora and Perma, were subject to severe and frequent or infrequent defoliations prior to regrowth. Aurora, which had a higher content of fructans in leaf sheaths than Perma before defoliation, produced more leaf biomass within the 4 d following the first cut. At the end of regrowth, Aurora produced more leaf biomass than Perma. Photosynthetic parameters were barely affected by defoliation frequency or varieties and could not explain the differences. Persistence of grassland species is dependant on their ability to accumulate high levels of carbohydrates in their tiller base. 1-SST and 6G-FFT activities declined after defoliation. In leaf sheaths, transcript levels mostly followed the time-course of the activities while in elongating leaf bases, they did not decrease concomitantly. This might represent an advantage for plants that regrow after defoliation.
Les fructanes sont les réserves carbonées majeures du ray-grass anglais (Lolium perenne L.). Pour mieux comprendre leur implication dans la croissance foliaire et dans la tolérance à la défoliation, plusieurs enzymes de synthèse des fructanes ont été caractérisées et leur régulation a été étudiée. Nous avons construit et criblé une banque d’ADNc de ray-grass avec une sonde correspondant à la fructane:fructane 6G-fructosyltransférase (6G-FFT) d’oignon (Allium cepa) et à la saccharose:fructane 6-fructosyltransférase (6-SFT) du pâturin (Poa ampla). Les clones isolés, Lp6G-FFT et Lp6-SXT, ont été exprimés dans Pichia pastoris et/ou les cellules d’insecte Sf9. Les protéines recombinantes obtenues présentent respectivement une activité 6G-FFT associée à une activité fructane:fructane 1 fructosyltransférase (1-FFT), et une activité 6-SFT. L’activité 6-SFT n’est pas identique à celle décrite chez l’orge dans la mesure où elle n’utilise pas le 1-kestotriose comme accepteur de résidu fructose, mais le 6G-kestotriose. D’autres accepteurs potentiels sont actuellement à l’étude. Les résultats obtenus nous conduisent à reconsidérer la voie de biosynthèse des fructanes chez le ray grass. Les fructanes y seraient produits grâce à trois enzymes plutôt que quatre, comme cela avait été suggéré par Pavis et al. (2001a) : 1-SST, 6G-FFT/1-FFT et 6-SFT. La saccharose:saccharose 1 fructosyltransférase (1-SST) produit le 1-kestotriose, la 6G-FFT synthétise les inulines et les fructanes de la néosérie inuline en utilisant le 1-kestotriose comme donneur de résidu fructose et le saccharose comme accepteur, et la 6-SFT produit les fructanes de la néosérie lévane en utilisant le saccharose comme donneur de résidu fructose et probablement le 6G-kestotriose comme accepteur. L’activité de la 1-SST et celle de la 6G-FFT ont été suivies en fonction du stade de développement, du tissu et du statut carboné. Lp1-SST, Lp6G-FFT et Lp6-SXT sont majoritairement exprimés dans la partie basale des feuilles en croissance et des gaines. Leur expression diminue le long de l’axe des feuilles, en même temps que les teneurs en fructanes et les activités fructosyltransférasiques. Curieusement, Lp6G-FFT est fortement exprimé dans les tissus photosynthétiquement actifs alors que l’activité correspondante et les teneurs en fructanes y sont à peine détectables, ce qui suggère une régulation post-transcriptionnelle. Lp1-SST et Lp6-SXT sont aussi fortement exprimés dans les limbes de plantes dont la synthèse des fructanes est activée, sans que l’activité 1-SST et les fructanes ne soient accumulés. La régulation de Lp1-SST, Lp6G-FFT et Lp6-SXT dépend donc du tissu, selon qu’il est puits ou source de carbone. Pour mieux comprendre la régulation du métabolisme des fructanes en réponse à la défoliation chez Lolium perenne, et pour évaluer le rôle de l’assimilation du carbone des nouveaux tissus foliaires dans la repousse, deux variétés contrastées du point de vue de leur teneur en sucres solubles, Aurora et Perma, ont été soumises à des coupes sévères et répétées. Aurora, qui avait accumulé plus de fructanes dans ses gaines foliaires que Perma, produit davantage de biomasse foliaire au cours de la première repousse. Au terme de la cinétique de repousse de 29 jours, Aurora produit davantage de biomasse que Perma. A priori, les paramètres photosynthétiques, pratiquement identiques chez les deux variétés, ne permettent pas d’expliquer les différences observées de production de biomasse foliaire. La persistance des espèces prairiales dépend de leur capacité à accumuler des teneurs élevées de sucres à la base de leurs talles. Les activités 1-SST et 6G-FFT diminuent après la coupe. Dans les gaines, les transcrits évoluent comme les activités tandis que dans les bases de feuilles en croissance, leurs teneurs ne diminuent pas conjointement à la chute des activités. Ceci peut représenter un avantage pour la plante qui repousse après la coupe.