Déterminisme du pouvoir protecteur de Fusarium oxysporum : recherche de gènes impliqués dans l'interaction protectrice avec la tomate
Résumé
Fusarium oxysporum is a common soil borne fungus, well represented in every type of soils, throughout the world. This species includes pathogenic strains inducing severe diseases in many crops and strains able to protect a plant against the infection by a pathogenic strain. The protective strains are not only non pathogenic strains isolated from suppressive soils but also pathogenic strains applied to a non host plant. The protective capacity of these strains is mainly based on mechanisms of competition and induced resistance of the plant The main objective of this work was to identify fungal genes involved in the protective capacity of these strains and associated to the elicitation of plant defence mechanisms. The approach consisted in looking for genes differentially expressed during the interaction between tomato cell cultures and either a protective or a non protective strain of F. oxysporum. An experimental model was developed; it is based on a strain of F. oxysporum f. sp. melonis (Fom24) pathogenic on muskmelon (Fom24) and on its transposition mutant (rev157). The wild type strain has the capacity to protect flax and tomato against fusarium wilt, although rev157 has lost the protective capacity. This mutant being neither affected in its capacity to grow saprophytically, nor to colonize the plant roots, the hypothesis that it was affected in its capacity to elicitate the plant defence reactions was proposed. Indeed, when interacting with cell cultures it induced physiological events (H2O2 accumulation, cell death) different from that induced by the wild type strain Fom24. Having no a priori hypothesis regarding the functions of the genes affected by the mutation, a Rapid Subtraction Hybridization (RaSH) technique was used to identify genes differentially expressed during the interaction between tomato cell cultures and either the protective or the non protective strain of F. oxysporum. This technique enabled to identify sequences from both fungal and plant origin. Since data concerning fungal genes are scarce in Genbank, the most informative data concerned plant genes. Regarding fungi, the expression of two genes, a chitinase and a polyphenol oxydase respectively involved in the degradation of cell walls and the oxidative catalysis of phenols was analyzed by Northern blot. Regarding plant genes, no newly expressed sequence was detected, demonstrating that the protective interaction results from a differential regulation of genes already expressed during the non protective interaction between plant cells and conidia of F. oxysporum. The expression profile of 5 genes was analyzed by Northern blot and real time PCR. Two of them are involved in the plant response to pathogen infection (RIN4, chitinase), and the 3 others are involved in important functions related to metabolism and transport (ATPase, ferredoxin-NADP-reductase and porin). The low activity of the ferredoxin-NADP-reductase in the cells interacting with the protective strain can be correlated with the great of amount H2O2 produced by these cells. The most interesting result concerns the demonstration that RIN4, a gene implicated in a guard system, is involved in the interaction between cells of tomato of a susceptible variety and different strains of F. oxysporum. Depending on the genetic environment of the cell (presence or absence of resistance genes) this gene either favors the growth of the pathogen or stimulates the plant defence reactions. The gene RIN4 being down-regulated during the protective interaction, the plant defence reactions would be fully expressed.
Au sein de l’espèce Fusarium oxysporum, on distingue des souches pathogènes provoquant des dégâts économiquement importants dans diverses cultures et des souches non pathogènes et protectrices. Ces dernières sont en effet capables de protéger les plantes auxquelles elles sont appliquées contre les formes pathogènes spécifiques de ces plantes. Outre les souches non pathogènes, généralement isolées de sols résistants, des souches pathogènes appliquées à une plante non hôte sont également capables de protéger cette plante contre la fusariose. Cette capacité de protection repose principalement sur des mécanismes de compétition et d’induction de résistance chez la plante. Dans le cadre de l’étude du déterminisme du pouvoir protecteur de certaines souches de F. oxysporum, l’objectif de ce travail est d’identifier des gènes fongiques associés à l’activation des mécanismes de défense de la plante et impliqués dans l’activité protectrice des souches de F. oxysporum. La démarche adoptée consiste à rechercher des gènes différentiellement exprimés lors de l’interaction de cultures cellulaires de tomate avec une souche protectrice et une souche non protectrice. Le modèle d’étude choisi est constitué d’une souche pathogène du melon F. oxysporum f. sp. melonis (Fom24) et de son mutant de transposition rev157. Alors que la souche sauvage Fom24 possède une capacité protectrice vis-à-vis de la fusariose du lin et de la tomate, son mutant rev157 présente une capacité protectrice significativement diminuée. Ce mutant n’étant affecté ni dans ses caractéristiques de croissance in vitro, ni dans sa capacité à coloniser les racines des plantes, l’hypothèse selon laquelle il est affecté dans sa capacité à induire les réactions de défense de la plante a été formulée. En interaction avec des cultures cellulaires, il induit des évènements physiologiques (accumulation de H2O2, mort des cellules) différents de ceux induits par la souche sauvage Fom24. N’ayant aucun a priori quant aux gènes affectés par la mutation, une méthode d’hybridation soustractive rapide a été mise en œuvre pour identifier des gènes différentiellement exprimés lors de l’interaction entre des cultures cellulaires de tomate et les souches de F. oxysporum. Cette méthode a permis d’identifier des séquences d’origine fongique et végétale ; la caractérisation de ces dernières étant plus facile en raison de l’abondante information disponible dans les banques de données. Concernant les champignons, nous avons analysé par Northern blot l’expression de deux gènes de fonction connue impliqués dans la dégradation de la paroi cellulaire (chitinase) ou dans la catalyse oxydative des phénols (polyphénol oxydase). Concernant les gènes de plante, aucune séquence nouvellement exprimée n’a été détectée, démontrant que l’interaction protectrice résulte d’une régulation différentielle de gènes également exprimés lors de l’interaction non protectrice. Le profil d’expression de cinq gènes a été confirmé par Northern blot et RT-PCR en temps réel. Deux d’entre eux sont impliqués dans la réponse de la plante à l’attaque d’un agent pathogène (RIN4, chitinase) et les trois autres correspondent à des fonctions importantes dans le métabolisme ou le transport (sous-unité β de l’ATP synthase, ferredoxine-NADP réductase, porine). La faible activité de la ferredoxine-NADP réductase lors de l’interaction des cellules avec la souche protectrice peut être corrélée à la quantité importante d’H2O2 produite par ces cellules. Le résultat le plus original concerne la mise en évidence du gène RIN4 impliqué dans un système de garde, lors de l’interaction entre des cellules de tomate d’une variété sensible et des souches de F. oxysporum protectrice on non. Selon le contexte génétique (présence ou non de gène de résistance) ce gène contribue en effet à favoriser le développement de l’agent pathogène ou au contraire à stimuler les défenses de la plante. Le gène RIN4 étant sous exprimé lors de l’interaction protectrice, les réactions de défense peuvent s’exprimer pleinement.