Contribution à l'étude des P450 impliqués dans la biosynthèse des furocoumarines
Résumé
Furocoumarins are phytoalexins known as efficient therapeutic agents. The work reported here focuses on cytochromes P450 involved in their biosynthesis pathway. A ¤structure-function¤ study was realized to understand how C4H from Ruta graveolens (CYP73A32) can resist to psoralen mechanism-based inactivation. Two parts of the protein seems involved in the differential susceptibility of CYP73A32 and CYP73A1 to psoralen. The first, between amino acids 31 and 58, defines differential affinity to psoralen. The second between residues 229 and 379 controls inactivation kinetic. The second part of this work was devoted to cloning and identification of new P450 involved in furocoumarin biosynthesis. On the one hand, several partial cDNA were cloned from Ruta graveolens. On the other hand, CYP71AJ1, cloned from Ammi majus, was identified as a psoralen synthase. The specificity of CYP71AJ1 for marmesin was approached by the study of a 3D model.
Les furocoumarines sont des métabolites secondaires végétaux jouant un rôle de phytoalexines chez les plantes et présentant un potentiel thérapeutique important, notamment en dermatologie. Les travaux présentés dans ce document se sont focalisés sur l’étude des cytochromes P450 participant à leur voie de biosynthèse. Une étude des relations structure-fonction de la cinnamate-4-hydroxylase (C4H) a été réalisée. Les C4H de Ruta graveolens (CYP73A32), Petroselinum crispum (CYP73A10) et Ammi majus (CYP73A41), trois plantes productrices de furocoumarines, sont moins sensibles à l’inactivation autocatalytique par le psoralène que celle d’Helianthus tuberosus (CYP73A1) qui n’en produit pas. L’étude de mutants et de protéines chimères entre CYP73A1 et CYP73A32 a montré (i) que la « résistance » au psoralène des C4H de plantes productrices de furocoumarines est sans doute issue de processus évolutifs distincts et (ii) que deux régions protéiques sont impliquées dans l’inactivation différentielle entre CYP73A32 et CYP73A1. L’une, située entre les acides aminés 31 et 58, détermine la différence d’affinité pour le psoralène. L’autre, entre les résidus 229 et 379, contrôle la vitesse d’inactivation. L’étude d’un modèle 3D de CYP73A32 a permis d’étayer plusieurs hypothèses sur le rôle de résidus précis dans ces deux régions. Un travail de clonage et d’identification de nouveaux P450 impliqués dans la biosynthèse des furocoumarines a été entrepris. D’une part, plusieurs ADNc partiels ont été clonés par PCR à partir de tissus de Ruta graveolens enrichis en furocoumarines. D’autre part, la fonction de CYP71AJ1 isolé à partir de cultures cellulaires d’Ammi majus, a été identifiée. Il catalyse la conversion de la (+)-marmésine en psoralène correspondant à l’activité psoralène synthase et constitue le 1er P450 cloné et de fonction connue dans la voie des furocoumarines. La spécificité de CYP71AJ1 pour la (+)-marmésine a été approchée par l’étude d’un modèle 3D.