Biominéralisation de la coquille d'oeuf de poule : Mise en évidence d'un transport vésiculaire du minéral impliquant les protéines EGF-Like repeats and discoidin-like domains 3 (EDIL3) et Milk fat globule EGF-factor 8 (MFGE8) - INRAE - Institut national de recherche pour l’agriculture, l’alimentation et l’environnement Access content directly
Theses Year : 2019

Biomineralisation of the chicken eggshell: Demonstratio of a vesicular transport involving EGF-Like repeats and discoidin-like domains 3 (EDIL3) and Milk fat globule EGF-factor 8 (MFGE8) proteins

Biominéralisation de la coquille d'oeuf de poule : Mise en évidence d'un transport vésiculaire du minéral impliquant les protéines EGF-Like repeats and discoidin-like domains 3 (EDIL3) et Milk fat globule EGF-factor 8 (MFGE8)

Abstract

The chicken egg is an aseptic and a self-sufficient chamber allowing the harmonious development of the chicken embryo in 21 days. The eggshell is the first physical barrier of the egg, which protects the egg from mechanical and microbial stresses. During eggshell biomineralization in the uterine fluid, the organic matrix, which is secreted by the uterus, ensures a crucial role in this process. To decipher the role of two major proteins of the organic matrix (EGF-like repeats and discoidin-like domains 3 : EDIL3 et Milk fat globule EGF-factor 8 : MFGE8), in silico and experimental approaches were performed. We firstly investigated the common evolution history of EDIL3 and MFGE8. We have estimated a divergent point between both paralogs 480 million years ago. The results also allowed us to highlight a vesicular transport of mineral (amorphous calcium carbonate) involved in eggshell biomineralization. EDIL3 and MFGE8 proteins would guide the vesicles to the mineralizing site and consequently ensure a critical role in this transport. This work also described additional molecular actors involved in vesicles formation, in calcium and bicarbonates supply and to the stabilization of amorphous calcium carbonate. We therefore proposed a global and coherent model of mineral transport during eggshell calcification. In this model, three alternative pathways could be involved (transcellular, vesicular and paracellular). Further investigations will be necessary to determine the respective roles of these pathways
L’œuf de poule constitue une chambre close et autosuffisante pour permettre le développement extra-utérin d’un embryon. L’œuf amniotique a permis l’affranchissement définitif du milieu aquatique qui était jusqu’alors essentiel pour la reproduction des espèces. La coquille de l’œuf permet de protéger le contenu nécessaire au développement du poussin de la dessiccation et des éventuelles contaminations microbiennes. La coquille est ainsi désignée comme la première barrière de défense physique de l’œuf possédant des capacités mécaniques remarquables. D’une épaisseur de 0,3 mm et d’un poids de 6 g, ce biominéral résiste à 3-4 kg de pression statique. Sa formation implique un processus de biominéralisation qui compte parmi les plus rapides sur terre. Ce processus est médié par une matrice organique qui interagit avec la phase minérale afin de contrôler la croissance des cristaux de calcite qui composent la coquille. Afin de mieux comprendre le rôle de la matrice organique dans ce phénomène de biominéralisation, de nombreuses études ont permis d’identifier ses composants. L’essor des technologies d’analyses à haut-débit a eu un impact conséquent sur l’identification et la caractérisation des protéines de la matrice organique. Ainsi, le nombre de protéines identifiées dans la coquille est passé de 11 à plus de 900 entre 2006 et 2019. Dans l’intention de dépasser l’étape de criblage moléculaire et de hiérarchiser les protéines de la matrice organique, les études qualitatives ont été complétées par des études quantitatives et prédictives des fonctions de ces protéines dans ce processus de minéralisation. Ainsi, une étude a mentionné 22 protéines comme étant des acteurs moléculaires clefs du processus. Parmi celles-ci, EDIL3 (EGF-like repeats and discoidin-like domains 3) et MFGE8 (Milk fat globule-EGF factor 8), sont deux protéines, rapportées dans la majorité des études à haut débit et qui semblent donc avoir un rôle clef dans la formation de la coquille. Dans ce contexte, mes recherches avaient pour but de caractériser ces deux protéines clefs, dont les fonctions lors de la calcification de la coquille étaient jusqu’alors inexplorées. Notre premier objectif a été de caractériser les protéines EDIL3 et MFGE8 chez la poule et de déterminer leur rôle dans le processus de minéralisation de la coquille d’œuf de poule. Ainsi, nous avons retracé l’histoire évolutive commune de ces deux protéines, qui indique une divergence il y a environ 480 millions d’années ayant donné lieu aux protéines EDIL3 et MFGE8. Nos analyses d’expression des gènes Edil3 et Mfge8 de Gallus gallus, du niveau de leurs protéines encodées et de leur structure tridimensionnelle, ont ensuite permis de proposer un nouveau modèle cohérent pour la minéralisation de la coquille des oiseaux. Dans ce modèle, les protéines EDIL3 et MFGE8 seraient impliquées dans un transport vésiculaire qui permettrait de délivrer une phase de carbonate de calcium amorphe (ACC) stabilisée, sur le site de la minéralisation. Notre second objectif a alors été de valider de manière expérimentale, ce nouveau modèle de transport vésiculaire du minéral pour la calcification de la coquille, et de caractériser ses acteurs moléculaires clefs. Ainsi, des activités de bourgeonnements de la membrane, libérant les vésicules dans le fluide utérin, ont été visualisées via une analyse de microscopie électronique. La présence d’ACC à l’intérieur des vésicules extracellulaires repérées dans le fluide a ensuite été validée via des techniques de spectroscopies (spectroscopie des pertes d’énergie ; EELS et spectroscopie de rayons-X à dispersion d'énergie ; EDS) et de diffraction des rayons-X. L’identification des principaux acteurs moléculaires (analyse d’expression génique, protéomique, immunofluorescence et immunoblots), a finalement permis de dresser un schéma qui résume ce mécanisme assurant la stabilisation et le transport spécifique de l’ACC. Ainsi, les protéines ANXA1, ANXA2 et ANXA8 permettraient l’apport des ions calcium dans la vésicule tandis que l’enzyme CA4 assurerait l’apport des ions bicarbonates dans cette dernière, afin de permettre la formation de l’ACC. Ce dernier pourrait être stabilisé par des conditions physico-chimiques intravésiculaires optimales et la présence de protéines telles que l’ovalbumine et le lysozyme. De plus, la protéine EDIL3, et potentiellement la protéine MFGE8, pourraient de leur côté assurer l’adressage des vésicules sur le site de la minéralisation via leur domaine de liaison au calcium. Enfin, les protéines PDCD6IP, Syntenin- 1 et Ezrin pourraient être impliquées dans la biogénèse des vésicules. En conclusion, notre étude a conduit à la mise en évidence d’un transport vésiculaire du carbonate de calcium amorphe durant la biominéralisation de la coquille d’œuf de poule. C’est la première fois qu’un tel mécanisme est démontré dans un processus de biominéralisation carbonatée chez les vertébrés. En outre, la validation de cette voie vésiculaire a conduit à l’élaboration d’un modèle global qui résume le transport des précurseurs minéraux des vaisseaux sanguins via l’utérus et le fluide utérin jusqu’au front de minéralisation. Ainsi, les 3 voies qui seraient employées pour fournir les précurseurs minéraux durant la minéralisation de la coquille seraient : la voie transcellulaire, la voie vésiculaire et potentiellement la voie paracellulaire. Les résultats de cette thèse ont contribué à l’apport de nouvelles connaissances aussi bien fondamentales (physiologie de la poule et mécanismes généraux de la biominéralisation) que pour développer de potentielles applications pour la filière œuf (nutrition et amélioration génétique).
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Dates and versions

tel-03659231 , version 1 (04-05-2022)

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  • HAL Id : tel-03659231 , version 1

Cite

Lilian Stapane. Biominéralisation de la coquille d'oeuf de poule : Mise en évidence d'un transport vésiculaire du minéral impliquant les protéines EGF-Like repeats and discoidin-like domains 3 (EDIL3) et Milk fat globule EGF-factor 8 (MFGE8). Génomique, Transcriptomique et Protéomique [q-bio.GN]. Université de Tours, 2019. Français. ⟨NNT : ⟩. ⟨tel-03659231⟩
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