Evolution of herbicide resistance in mugwort (Ambrosia artemisiifolia L.): search for genetic determinisms and application to molecular diagnosis
Évolution de la résistance aux herbicides chez l’Ambroisie à feuilles d'armoise (Ambrosia artemisiifolia L.) : recherche des déterminismes génétiques et application au diagnostic moléculaire
Résumé
Common ragweed (Ambrosia artemisiifolia L.), a particularly troublesome and allergenic weed, is mainly controlled in agricultural fields using ALS inhibitor herbicides. Recent cases of herbicide resistance have been reported in France and are jeopardising the efficacy of this mode of action. Both target site resistance (TSR, structural mutation in ALS gene) and non target site resistance (NTSR, regulatory and/or structural mutations in secondary metabolism) are involved. The fundamental aim of this work was to identify the genetic determinisms of resistance to ALS inhibitors that have evolved in common ragweed populations in France. As an applied objective, this work also aimed to prepare the development of a high- throughput molecular diagnostic tool that would ensure a rapid detection of resistance. We first assessed the situation of common ragweed resistance in France and identified the mechanisms involved and their modalities of evolution. Using herbicide sensitivity bioassays coupled with ALS gene sequencing, we showed that ragweed resistance to two active substances, imazamox and tribenuron, is emerging in France and is mainly due to NTSR mechanisms. The observed resistance patterns suggest that a diversity of NTSR mechanisms are evolving in France. Furthermore, we demonstrated that TSR evolved locally, through multiple and independent appearance of mutations in the ALS gene. Thanks to the innovative application of high- throughput sequencing for the diagnosis of TSR on a national scale, we identified several foci of TSR emergence, as well as an unsuspected diversity of mutations in the ALS gene. We then studied the genetic determinisms of NTSR. A transcriptomic approach (RNASeq) associated with an analysis of nucleotide polymorphisms was conducted, based on the hypothesis that genes and/or markers of NTSR differed by their expression level and/or by sequence polymorphisms between plants resistant or sensitive to ALS inhibitors. For the first time, this approach was conducted directly on field plant material, i.e. six populations with distinct geographical origins and/or resistance profiles. Constitutive expression differences between resistant and sensitive plants were identified, especially in genes from families known to be involved in herbicide metabolism (cytochromes P450, transferase enzymes, transporters, etc.), but also in genes that may be involved in regulatory cascades activated by the herbicide. Validation of their relative expression levels and their ability to predict NTSR was performed on a massive sampling of plants. Taken together, the results indicate that a very high diversity of mechanisms is involved in RNLC within and between populations, highlighting the highly polygenic nature of RNLC in ragweed. In addition, assessment of the early response of plants to herbicide application showed that genes involved in secondary plant metabolism are specifically induced by treatment in resistant plants from different populations. Finally, sequence variants potentially correlated with NTSR were identified. Their validity as resistance markers remains to be confirmed. The diversity of resistance mechanisms identified within each population renders the development of a molecular diagnosis tool complex. On the other hand, it opens exciting perspectives for the study of the evolutionary dynamics of the adaptation of an invasive species subjected to a particularly intense anthropogenic selection pressure.
L’ambroisie à feuilles d’armoise (Ambrosia artemisiifolia L.) est une adventice nuisible et allergisante, principalement contrôlée en milieu agricole par des herbicides de la famille des inhibiteurs de l’acétolactate synthase (ALS). L’efficacité de cette gestion chimique a récemment été confrontée à l’apparition de cas de résistance impliquant les deux grandes catégories de mécanismes : la résistance liée à la cible (RLC, mutations structurales dans le gène de l’ALS) et la résistance non liée à la cible (RNLC, mutation régulatrices et/ou structurales du métabolisme secondaire). L’objectif fondamental de ce travail était d’identifier des déterminismes génétiques de la résistance aux inhibiteurs de l’ALS ayant évolué chez l’ambroisie en France. D’un point de vue appliqué, ce travail visait également à préparer le développement d’un outil de diagnostic moléculaire « à haut débit » destiné à assurer un diagnostic rapide de la résistance. Dans une première partie, nous avons évalué la situation de la résistance de l’ambroisie en France, caractérisé les mécanismes en cause et leurs modalités d’évolution. À l’aide de tests biologiques couplés au séquençage du gène de l’ALS, nous avons montré que la résistance de l’ambroisie à deux substances actives, l’imazamox et le tribénuron, est émergente en France, et principalement due à des mécanismes de RNLC. Les profils de résistance observés suggèrent qu’il existe une diversité de mécanismes de RNLC. Concernant la RLC, nous avons montré qu’elle évolue localement, par l’apparition multiple et indépendante d’allèles mutants de l’ALS. L’application innovante du séquençage à haut débit pour le diagnostic de la RLC à l’échelle nationale a permis d’identifier plusieurs foyers émergents de RLC, ainsi qu’une diversité insoupçonnée de mutations dans le gène de l’ALS. Dans une seconde partie, nous nous sommes concentrés sur la recherche de déterminismes génétiques de la RNLC. Une approche transcriptomique (RNASeq) associée à la recherche de polymorphismes nucléotidiques a été conduite, sur l’hypothèse que des gènes et/ou des marqueurs de la RNLC peuvent être identifiés sur la base de leur niveau d’expression et/ou de polymorphismes de séquence caractéristiques des plantes résistantes aux inhibiteurs de l’ALS. Pour la première fois, cette approche a été conduite directement sur du matériel végétal du champ, à savoir : six populations possédant des origines géographiques et/ou des profils de résistance distincts. Des différences d’expression constitutives entre plantes résistantes et sensibles ont été identifiées. Elles concernaient notamment des familles de gènes dont l’implication dans la métabolisation des herbicides est connue (cytochromes à P450, enzymes à activité transférase, transporteurs…), ainsi que des gènes pouvant intervenir dans des cascades de régulation activées par l’herbicide. La validation du niveau d’expression relatif et de la capacité des candidats à prédire la RNLC a été effectuée à partir d’un échantillonnage massif de plantes. L’ensemble des résultats indique qu’une très grande diversité de mécanismes est impliquée dans la RNLC au sein et entre chacune des populations, soulignant le caractère hautement polygénique de la RNLC chez l’ambroisie. En outre, l’analyse de la réponse précoce des plantes au traitement a montré que des gènes impliqués dans le métabolisme secondaire des plantes sont spécifiquement induits par le traitement chez les plantes résistantes des différentes populations. Enfin, des polymorphismes potentiellement corrélés à la RNLC ont été identifié. Leur validité en tant que marqueurs de résistance reste à vérifier. La diversité des mécanismes identifiés au sein de chacune des populations rend le développement d’un outil de diagnostic moléculaire complexe, mais ouvre des perspectives passionnantes quant à l’étude de la dynamique évolutive de l’adaptation d’une espèce envahissante soumise à une pression de sélection anthropique particulièrement intense.