identification of cis-DNA sequences necessary for replication initiation in vertebrates
Identification de séquences cis-nucléiques nécessaires à l'initiation de la réplication chez les vertébrés
Résumé
Most origins of replication mapped in mouse and human cells are associated with a G-rich motif that can form a G-quadruplex (G4). However, experimental proofs showing whether G4 are necessary for replication initiation in vertebrates remained to be collected. To answer this question we used homologous recombination in avian DT40 cells to target at the same locus wild type and mutated versions of the chicken βA promoter/replicator that contains a characterized G4. The results were confirmed in a new mode) origin, the med14 promoter that contains two G4 motifs. Origin activities were quantified by qPCR on Small Nascent Strands (SNS) specific of replication origins and confirmed by a new method, developed in our laboratory, based on DNA replication timing. Origin activity is dramatically reduced after G4 deletion showing its critical role in origin selection. Moreover, the two G4 motifs cooperate to create an active med14 replicator. The probability to destabilize βA G4 by several point mutations inside the G4 is correlated with the efficiency of replication initiation proving that replicator needs G4. Moreover, G4 is not only necessary for replication initiation but also positions the replication start site. We demonstrated that the G4 is not sufficient for origin activity and cooperates with a flanking 200 bp cis-element that contains a CCAAT box and potential binding sites for factors. Taken together, our data confirm the important rote of G4 in origin selection and show that these elements cooperate with cis-elements that have the capacity to be bound by transcription factors.
Des études à large échelle dans des cellules humaines et de souris ont identifié un motif riche en G, ayant la possibilité de former un G-quadruplexe (G4), associé à la majorité des origines de réplication. Cependant les preuves expérimentales de la nécessité des G4s dans l'initiation de la réplication chez les vertébrés restaient inexistantes. Nos résultats montrent que l'activité de l'origine modèle βA est diminuée de façon drastique lorsque le motif G4 est supprimé montrant le rôle crucial de ce motif pour le réplicateur. Dans une nouvelle origine modèle med14, deux motifs G4 coopèrent pour initier la réplication. Des mutations ponctuelles dans le G4 de βA affectant à des degrés variés sa stabilité ont montré que l'efficacité de l'origine de réplication était fortement corrélée avec la stabilité du G4. De plus, l'orientation du G4 détermine le positionnement du site d'initiation de la réplication. L'ensemble de ces résultats suggère fortement l'implication de G4s dans l'initiation de la réplication. Enfin, le G4 n'est pas suffisant pour l'initiation de la réplication et nécessite la coopération d'une séquence nucléique adjacente de 200 pb contenant des sites de fixations pour des facteurs de transcription comme la boîte CCAAT. Pour conclure, nos données confirment le rôle crucial des G4s dans l'initiation de la réplication et montrent que ces éléments structuraux doivent coopérer avec des modules flanquants pouvant fixer des facteurs de transcription.