LES CANAUX ANIONIQUES DE LA MEMBRANE PLASMIQUE CHEZ ARABIDOPSIS THALIANA: CARACTÉRISATION FONCTIONNELLE ET MISE EN PLACE D'OUTILS POUR L'IDENTIFICATION MOLÉCULAIRE - INRAE - Institut national de recherche pour l’agriculture, l’alimentation et l’environnement Accéder directement au contenu
Thèse Année : 2001

PLASMA MEMBRANE ANION CHANNELS IN ARABIDOPSIS THALIANA: FUNCTIONAL CHARACTERIZATION AND DEVELOPMENT OF TOOLS FOR MOLECULAR IDENTIFICATION

LES CANAUX ANIONIQUES DE LA MEMBRANE PLASMIQUE CHEZ ARABIDOPSIS THALIANA: CARACTÉRISATION FONCTIONNELLE ET MISE EN PLACE D'OUTILS POUR L'IDENTIFICATION MOLÉCULAIRE

Jean Colcombet

Résumé

The function of plasma membrane anion channels in plant cells is well understood only in a few cases of specialized cells: osmotic regulation (for stomatal guard cells) and stress responses (for root epidermal cells). The laboratory where I prepared my thesis is involved in studies of Arabidopsis thaliana hypocotyl, an organ with less specialized cells. My PhD work is divided into two parts: first I was involved in the characterization of two anion channels at the plasma membrane of hypocotyl epidermal cells and I have looked for their involvement in a particular function, and second I have developed functional screens to identify anion channel genes. The first anion channel that I contributed to characterize is a channel with rapid kinetics, permeable to several anions. Among them, sulfate exerts an activating effect. Moreover, I have described the biophysical mechanism of the channel gating by voltage: the channel pore is blocked by a nucleotide molecule at very negative potentials. Extracellular anions are able to exert a repulsion on the nucleotide. This dual regulation modulates channel activity in the range of physiological voltages. I have also contributed to the characterisation of a second anion channel with slow kinetics, present on the same cells. This channel is weakly voltage-dependent, shows a high nitrate permeability, and is regulated by phosphorylation. To look for the physiological function of these channels, I have chosen to characterize anion effluxes from Arabidopsis suspension cells, which also posses these two types of channels. In resting conditions, no efflux was observed: channels are closed. Only few signals, hypoosmotic chock and bacterial and fungal elicitors, are able to trigger an efflux. Considering the pharmacological and selectivity profiles of these effluxes, we have not be able to clearly involve any of the rapid-type or the slow-type anion channels. On the basis of anion channel properties described using the patch-clamp technique, I have developed two functional screens using heterologous systems to identify channel cDNAs. The first one, based on channel selectivity for toxic anions, is developed in yeast. Positive controls did not allow us to define conditions for a positive screen but might provide conditions for a negative screen. The second one, based of the activating effect of sulfate on the rapid anion channel, is currently being investigated in Xenopus oocytes.
La fonction des canaux anioniques présents sur la membrane plasmique des cellules végétales n'est comprise que dans un nombre restreint de cas correspondant à des activités particulières dans des cellules spécialisées: la régulation osmotique (cellules de garde des stomates) et la tolérance aux stress (cellules épidermiques de racine). Le laboratoire dans lequel j'ai effectué ma thèse s'intéresse plus particulièrement à l'hypocotyle d'Arabidopsis thaliana, organe ayant des types cellulaires moins clairement spécialisés. Mon travail de thèse comprend deux volets, d'une part j'ai contribué à la caractérisation de deux canaux anioniques de la membrane plasmique et j'ai recherché leur implication dans certaines réponses cellulaires, d'autre part j'ai développé des cribles fonctionnels afin d'identifier les gènes codant pour ces canaux. Le premier canal que j'ai contribué à caractériser dans les cellules épidermiques de l'hypocotyle, est un canal à cinétiques rapides perméant à différents anions. Parmi ceux-ci, le sulfate a un rôle activateur du canal. J'ai de plus décrit le mécanisme biophysique de la régulation par le voltage du canal rapide: le pore du canal est obstrué par une molécule de nucléotide aux potentiels hyperpolarisés. Les anions externes sont capables de chasser le nucléotide hors du pore par un phénomène répulsif. Cette double régulation module l'activité du canal dans une gamme de potentiels physiologiques. Enfin, j'ai participé à l'identification d'un second canal à cinétiques lentes sur les mêmes cellules. Ce canal est faiblement régulé par le potentiel de membrane et présente une perméabilité très en faveur du nitrate. Il est régulé par phosphorylation. Pour rechercher la fonction physiologique de ces deux canaux, j'ai choisi de caractériser les efflux d'anions dans le système des cellules d'Arabidopsis en suspension, qui sont aussi équipées de ces canaux. Au repos, aucun efflux d'anions n'est mesuré: les canaux sont fermés. Peu de signaux sont capables de les activer, parmi lesquels un choc hypoosmotique et certains éliciteurs de type fongique et bactérien. La caractérisation de ces efflux, grâce aux outils pharmacologiques et à la sélectivité ionique, n'a pas permis d'impliquer clairement un des canaux anioniques décrits en patch-clamp. Sur la base des propriétés des canaux décrites en patch-clamp, j'ai aussi développé deux cribles fonctionnels en système hétérologue pour tenter d'identifier les ADNc correspondants. Le premier, basé sur la sélectivité des canaux pour les anions toxiques, est réalisé en levure. Mes contrôles positifs n'ont pas permis de définir de conditions pour un crible positif mais ont ouvert des possibilités de cribles négatifs. Le second, fondé sur l'effet activateur du sulfate sur le canal rapide, est effectué en ovocyte de xénope et est en cours de validation.
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Citer

Jean Colcombet. LES CANAUX ANIONIQUES DE LA MEMBRANE PLASMIQUE CHEZ ARABIDOPSIS THALIANA: CARACTÉRISATION FONCTIONNELLE ET MISE EN PLACE D'OUTILS POUR L'IDENTIFICATION MOLÉCULAIRE. Sciences du Vivant [q-bio]. Université Pierre et Marie Curie, 2001. Français. ⟨NNT : ⟩. ⟨tel-04374112⟩
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