Microorganism proteotyping by tandem mass spectrometry
Protéotypage de micro-organismes par spectrométrie de masse en tandem
Résumé
The microbial biosphere is an important source of biological catalysts, but most remain to be identified and characterized. Phylopeptidomics is an innovative metaproteomics approach for taxonomical identification of prokaryotic and eukaryotic microorganisms, without any a priori. This PhD thesis aims to implement and optimize this methodology for screening microbial isolates, fast studying their potential, and selecting the most interesting variants. Technological improvements were achieved for the optimization of sample preparation, the simultaneous treatment of 96 samples, the decrease of LC-MS/MS time analysis and the automation of informatics data treatment. The sensibility and timeliness of the optimized approach were exemplified with the identification at the species taxonomical level of a significant number of isolates sampled from human dental plaque and waters from industrial facilities. The phylopeptidomics approach allowed to identify: i) prokaryotes and eukaryotes, as illustrated with the analysis of diverse isolates or mixtures of bacteria and the identification of Cordyceps confrogosa and Cladosporium herbarum eukaryotic fungi; ii) clinical bacteria with a more precise confidence at the species taxonomical level, in particular for some opportunist strains such as Serratia marcescens and Stenotrophomonas maltophilia and; iii) species originated from scarcely studied environments, for which reference strains are not yet sequenced but closely related organism genomes are available in the database, enabling determination of the strain phylogeny based on the nearest relative species. An original pan-proteomics approach was also designed for the characterization of the catabolic pathways of unsequenced microorganisms. Proteomic analysis of Hyphomicrobium sp. MC8b using a database that contains the genomic information of all closely-related strains led to the identification of proteins involved in dichloromethane degradation. Indeed, the most probable sequence of dichlorométhane dehalogenase was established. The potential of phylopeptidomics for environmental microorganisms large-scale screening was illustrated with the treatment of 96 samples in 55 hours and their accurate and unambiguous taxonomical identification, whatever their format: new bacteria or fungi isolates, or even mixtures of microorganisms.
La biosphère microbienne constitue une source importante de catalyseurs biologiques, dont l’identification et la caractérisation restent à ce jour limitées. La phylopeptidomique est une approche de métaprotéomique innovante pour l’identification taxonomique sans a priori des micro-organismes procaryotes et eucaryotes. Cette thèse a pour objectif d’optimiser la méthodologie à des fins de criblage d’isolats microbiens, d’étude rapide de leur potentialité, et de sélection des variants les plus intéressants. Les améliorations technologiques portent sur l’optimisation de la préparation d’échantillon, la préparation simultanée de 96 échantillons, la diminution du temps d’analyse LC-MS/MS et le traitement informatique des données. La sensibilité et la rapidité de l’approche optimisée ont été exemplifiées avec l’identification au niveau taxonomique espèce d’un nombre important d’isolats issus de la plaque dentaire et d’eaux prélevées dans des installations industrielles. La phylopeptidomique permet d’identifier : i) les micro-organismes procaryotes et eucaryotes, tel que démontré sur l’analyse de diverses bactéries isolées ou en mélanges et l’identification des champignons eucaryotes Cordyceps confrogosa et Cladosporium herbarum ; ii) les bactéries cliniques avec une identification plus précise au rang taxonomique de l’espèce comparé à d’autres méthodes d’analyses telles que le MALDI-TOF, notamment pour certaines espèces opportunistes telles que Serratia marcescens et Stenotrophomonas maltophilia et ; iii) les espèces issues d’environnements peu étudiés, dont les souches de référence ne sont pas encore séquencées mais pour lesquelles des génomes d’organismes très proches sont disponibles dans la base de données et permettent d’établir la phylogénie de la souche d’intérêt jusqu’à l’espèce la plus proche. Une approche originale de pan-protéomique a aussi été conçue pour la caractérisation des voies métaboliques d’un micro-organisme dont le génome n’est pas encore connu. L’analyse protéomique de la bactérie Hyphomicrobium sp. MC8b à partir d’une base de données qui regroupe les informations génomiques de l’ensemble des souches proches référencées a permis d’identifier les protéines impliquées dans la dégradation du dichlorométhane et notamment reconstituer la séquence probable de la dichlorométhane déhalogénase. L’intérêt de la phylopeptidomique pour le criblage de micro-organismes environnementaux à grande échelle a été démontré par le traitement de 96 échantillons en 55 heures et leur identification taxonomique précise et sans équivoque que ce soit pour de nouveaux isolats de bactéries, de champignons, voire des mélanges de microorganismes.