Identifier rapidement des microorganismes est essentiel dans le domaine du diagnostic clinique, des contrôles sanitaires et alimentaires, et du criblage pour applications biotechnologiques. Améliorer les méthodes d'identification afin qu'elles soient plus rapides et sensibles est un enjeu de taille. Actuellement, le protéotypage par spectrométrie de masse MALDI-TOF est la méthode de référence pour les isolats bactériens dans les laboratoires de microbiologie clinique. Toutefois, cette méthodologie n'est pas en mesure de traiter la plupart des isolats environnementaux et des agents pathogènes opportunistes en raison d'une base de données de spectres expérimentaux incomplète. En enregistrant beaucoup plus d'informations sur les séquences au niveau des peptides, le protéotypage par spectrométrie de masse en tandem est capable d'identifier la position taxonomique de n'importe quel micro-organisme dans l'arbre de la vie, et peut s'avérer hautement discriminant au niveau des sous-espèces. Cette thèse a pour objectif d'adapter et rendre haut-débit une approche d'identification de microorganismes sans a priori par protéotypage de microorganismes, développée au laboratoire. La phylopeptidomique repose sur l'enregistrement de données de séquences peptidiques par spectrométrie de masse en tandem et l'association de ces données taxonomiques, permettant d'identifier l'organisme. Afin de réduire les coûts et le temps d'analyse, deux méthodes ont été inventées et testées durant ma thèse pour identifier tout type de microorganismes en quelques minutes d'analyse. La première méthode permet de multiplexer sans marquage plusieurs échantillons en créant un mélange contenant des fractions de chaque isolat qui différent en hydrophobicité. La robustesse, la reproductibilité et les limites de cette méthode ont été évaluées. La seconde méthode utilise les capacités de rapidité d'une analyse par infusion directe, permettant de réduire le temps d'analyse à 36 secondes de spectrométrie.