En physiologie de la reproduction, fonctionnement de l’ovaire soulève encore de nombreux questionnements, notamment sur la régulation de la folliculogenèse qui amène à la croissance et à l’atrésie des follicules, la capacité à ovuler un ovocyte de qualité chaque cycle, jusqu’à la formation du corps jaune et à la lutéolyse, important pour la conception. De plus, est-ce une hiérarchie fonctionnelle entre les follicules en raison de leur positionnement dans l’organe et de leur niveau de vascularisation modulerait certaines voies métaboliques majeures, notamment celles des lipides ? Pour répondre à ces questions, l’imagerie moléculaire 2D/3D par spectrométrie de masse MALDI-TOF se trouve être un outil de choix pour suivre la distribution des lipides au sein de ce tissu très différentié et dynamique de l’ovaire. Ici, à partir d'un modèle animal de ruminant mono-ovulatoire, la brebis, nos premières investigations en imagerie 2D sur les coupes d’ovaires ont permis, à l’aide de la détection d’espèces lipidiques endogènes, de caractériser distinctement le tissu interstitiel, le corps jaune, les follicules comprenant le fluide folliculaire et les différentes cellules folliculaires tels que cellules de cumulus, cellules de granulosa et thèque jusqu’à détention de l’ovocyte à l’intérieure du follicule (Figure 1). De plus, la reconstruction 3D de 72 coupes sériées a permis d’accéder à la topographie spatiale des follicules dans l'ensemble de l'ovaire et d’obtenir une cartographie précise des vaisseaux sanguins autour du follicule dominant destiné à ovuler. La détection de l’hème de l'hémoglobine, une signature des vaisseaux sanguins, a été confirmée par immunohistochimie ciblant Hémoglobine A1. Ces premiers résultats ont ainsi permis d’obtenir des informations anatomiques et structurelles et d’initier de nouvelles voies d’investigation, grâce à la cartographie précise des lipides dans les follicules de taille variées, pour mieux comprendre leur implication dans la différenciation des follicules lors de la folliculogenèse terminale.