(trad auto)Functional microbial groups applied in the methanization of cellulose and methanol: diversity, function and influence of temperature
Groupes microbiens fonctionnels appliqués dans la méthanisation de la cellulose et du méthanol : diversité, fonction et influence de la température
Résumé
(trad auto)In order to better understand the functioning of the microbial communities involved in the methanization of cellulose and methanol, samples from the anaerobic digestion of waste were incubated in the presence of cellulose, glucose, acetate and methanol enriched with carbon 13, under mesophilic and thermophilic conditions. After extraction and separation of heavy and light DNA by ultracentrifugation on density gradients (SIP technique), functional diversity was characterized by molecular inventory and phylogenetic analysis. A total of 20 clone banks containing bacterial 16S rDNA genes (1251 sequences) and 19 clone banks containing Archean 16S rDNA genes (1312 sequences) were obtained under mesophilic and thermophilic conditions. Specific oligonucleotides were then developed and hybridized using the in situ fluorescent hybridization technique to confirm the presence of pre-identified functional groups. We then focused on studying the relationship between degradation kinetics, activated metabolic pathways and the functional groups involved, following the dynamics of functional diversities using the single-strand conformational polymorphism (SSCP) technique. By applying these techniques in combination on a series of functionally connected substrates, we reveal networks of non-cultivable microorganisms involved in the methanization of cellulose and methanol. The incubation temperature influences the general diversity while the addition of substrates plays an important role in functional diversity. Microorganisms belonging to the genus Acetivibrio and the order Halanaerobiales are, respectively, the main groups hydrolyzing cellulose under mesophilic and thermophilic conditions. Microorganisms belonging to the Porphyromonadaceae family and the genus Clostridium are the main fermenters of glucose. In addition, many microorganisms belonging to the Clostridia class, but distant from all listed cultivable strains, have been identified as functional groups in all incubations. Syntrophic oxidation of acetate is an important process in this ecosystem, which could be carried out by microorganisms similar to the genus Pseudomonas under mesophilic conditions. A high functional versatility has been demonstrated for thermophilic microorganisms and could help explain a faster and more efficient degradation of cellulose compared to that observed under mesophilic conditions. Finally, a new technique, called "SIMSISH" (Secondary Ion Mass Spectrometry In Situ Hybridization), has been developed as part of the work. It allows simultaneous visualization of microbial identity and measurement of isotopic enrichment at the scale of a cell. Coupled with SIP methodologies, this technique should lead to decisive progress in the in situ study of the contribution of non-cultivable microbial populations to the functioning of complex ecosystems"
Afin de mieux comprendre le fonctionnement des communautés microbiennes intervenant lors de la méthanisation de la cellulose et du méthanol, des échantillons issus de la digestion anaérobie de déchets ont été incubés en présence de cellulose, de glucose, d'acétate et de méthanol enrichis en carbone 13, en conditions mésophiles et thermophiles. Après extraction et séparation de l'ADN lourd et léger par ultracentrifugation sur des gradients de densité (technique SIP), la diversité fonctionnelle a été caractérisée par inventaire moléculaire et analyse phylogénétique. Au total, 20 banques de clones contenant des gènes d'ADNr 16S bactériens (1251 séquences) et 19 banques de clones contenant des gènes ADNr 16S archéens (1312 séquences) ont été obtenues en conditions mésophiles et thermophiles. Des oligonucléotides spécifiques ont ensuite été élaborés et hybridés selon la technique d'hybridation fluorescente in situ afin de confirmer la présence des groupes fonctionnels pré-identifiés. Nous nous sommes ensuite attachés à étudier la relation entre la cinétique de dégradation, les voies métaboliques activées et les groupes fonctionnels impliqués, en suivant la dynamique des diversités fonctionnelles à l'aide de la technique du polymorphisme de conformation simple brin (SSCP). En appliquant de manière combinée ces techniques sur une série de substrats fonctionnellement connectés, nous dévoilons des réseaux de microorganismes non cultivables impliqués dans la méthanisation de la cellulose et du méthanol. La température d'incubation influence la diversité générale tandis que l'ajout de substrats joue un rôle important sur la diversité fonctionnelle. Les microorganismes appartenant au genre Acetivibrio et à l'ordre Halanaerobiales sont, respectivement, les principaux groupes hydrolysant la cellulose en conditions mésophiles et thermophiles. Les microorganismes appartenant à la famille Porphyromonadaceae et au genre Clostridium sont les principaux fermenteurs du glucose. Par ailleurs, de nombreux microorganismes appartenant à la classe Clostridia, mais éloignés de toutes les souches cultivables répertoriées, ont été identifiés comme des groupes fonctionnels dans toutes les incubations. L'oxydation syntrophique de l'acétate est un processus important dans cet écosystème, qui pourrait être effectué par des microorganismes proches du genre Pseudomonas en conditions mésophiles. Une grande versatilité fonctionnelle a été mise en évidence pour les microorganismes thermophiles et pourrait contribuer à expliquer une dégradation de la cellulose plus rapide et efficace par rapport à celle observée en conditions mésophiles. Enfin, une nouvelle technique, baptisée "SIMSISH" (Secondary Ion Mass Spectrometry In Situ Hybridization), a été développée dans le cadre du travail. Elle permet de visualiser simultanément l'identité microbienne et de mesurer l'enrichissement isotopique à l'échelle d'une cellule. Couplée aux méthodologies SIP, cette technique devrait permettre des progrès décisifs pour l'étude in situ de la contribution des populations microbiennes non cultivables au fonctionnement des écosystèmes complexes.