La folliculogenèse in vitro consistant à induire conjointement une croissance folliculaire et une maturation ovocytaire est encore au stade de la recherche chez les grands mammifères. Il est donc crucial d’évaluer, à partir de paramètres appropriés, dans quelle mesure les conditions de culture folliculaire permettent au follicule et à l’ovocyte de se développer de façon harmonieuse et similaire à ce qui est observable in vivo. Différentes analyses allant de la transcriptomique par qPCR en microfluidique à l’expression protéique par immunomarquage après transparisation ou sur coupes congelées nous ont permis d’aborder cette évaluation. Le modèle animal choisi est l’agnelle. Après isolement à partir de lamelles de cortex ovarien, les follicules sont cultivés individuellement, en microgouttes de milieu aMEM+ supplémenté en insuline sous huile. Puis nous avons comparé les folliculoïdes cultivés sur 6, 13 et 20 jours in vitro aux follicules de même taille développés in vivo. Dans notre système de culture, les follicules se développent du stade préantral (180-240µm) jusqu’au stade antral (600-800µm) sur une période de 20 jours, plus courte que la durée in vivo estimée à 27 jours. Ce système de culture nous permet d’obtenir une morphogenèse folliculaire tout en maintenant une structure sphérique en 3D, le ‘folliculoïde’. Celui-ci se forme grâce à une croissance radiale à partir de l’ovocyte par multiplication des cellules somatiques de granulosa. Ce développement s’accompagne progressivement, d’une part de la différenciation des granulosa en cellules de cumulus entourant étroitement l’ovocyte ou en granulosa murales, et d’autre part de la formation d’une cavité de sécrétions folliculaires, l’antrum. Par clustering d’expression (ARN), nous avons montré une augmentation de l’expression de certains gènes du folliculoïde au cours de la culture in vitro mais aussi versus in vivo, comme par exemple un marqueur de prolifération cellulaire (CCND2) mais aussi de la stéroïdogenèse (CYP19A1), ce qui reflète une différenciation accentuée in vitro accompagnant la maturation folliculaire. Un gène majeur des jonctions gap impliquées dans la communication cellulaire, GJA1, voit son expression in vivo rester stable au cours de la croissance des follicules alors qu’elle augmente in vitro dans le folliculoïde. Un immunomarquage de la protéine correspondante, la connexine 43 (CX43), in situ après transparisation des follicules au CUBIC ou sur coupes congelées permet de visualiser une localisation punctiforme entre les cellules somatiques et une accumulation préférentielle à la périphérie de la zone pellucide de l’ovocyte au niveau des projections transzonales émises par les cellules de cumulus vers l’ovocyte. En conclusion, malgré un développement folliculaire d’apparence normale en culture, les profils d’expression des gènes et des protéines suggèrent une morphogenèse et une maturation accélérée des folliculoïdes in vitro. Reste à savoir si cette différenciation précoce des cellules somatiques s’accompagne également de celle de l’ovocyte, afin de permettre la production d’un ovocyte mature de qualité suffisante pour être fécondé et soutenir le développement embryonnaire précoce.